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Biologia Molecular

A aplicação de métodos de biologia molecular para a identificação de agentes infecciosos vem apresentando rápida evolução nos últimos anos, devido, em grande parte, ao desenvolvimento de novas técnicas de análise do DNA e do RNA. A identificação dos agentes infecciosos é baseada na detecção do DNA ou RNA, que torna possível também a quantificação de bactérias, fungos e vírus num prazo de poucas horas e garante sensibilidade e especificidade elevadas. A lista de microorganismos que podem ser detectados por técnicas moleculares é crescente, assim como o são as alternativas metodológicas.

Na análise do DNA ou RNA, os métodos podem ser divididos genericamente em dois grandes grupos: os de amplificação do material nucléico (em sua maioria métodos de PCR e seus variantes) e os que utilizam amplificação de sinal (nos quais se enquadram os de hibridização, como a captura híbrida e hibridização “in situ”).

Tipos de testes de DNA

  1. Hibridização “in situ” sobre filtro é técnica simples e rápida, utiliza células esfoliadas frescas; o resultado é avaliado à vista desarmada; requer, assim, grande quantidade de células para um bom resultado e tendência a dar resultados falso-positivos;
  2. Hibridização “in situ”, muito diferente da técnica anterior, utiliza fragmentos de tecidos parafinados ou esfregaços celulares fixados em lâmina; o resultado é analisado em microscópio. Lancaster & Jenson (1987) acreditavam que se tornaria o método mais utilizado;
  3. PCR (Reação de Polimerase em Cadeia) foi desenvolvida por Mullins (1983) e provocou grande impacto, pois a sua grande sensibilidade permite a amplificação a partir de amostras muito escassas de DNA ou RNA; no entanto essa característica torna o método susceptível à contaminação por material nucleico exógeno ou amplificado de outra amostra (Troffatter, 1997), não sendo aprovado pelo FDA ( American Food Administration) para uso comercial;
  4. Captura híbrida foi desenvolvido em 1992, por Lörincz, a partir de estudos realizados desde 1983 sobre os métodos já existentes. Amplifica o sinal dos híbridos formados, os quais são detectados por reação enzima-substrato, e sua leitura é feita por quimioluminescência. É teste fácil de ser realizado, em curto espaço de tempo, aprovado pelo FDA e pelo Ministério da Saúde para uso comercial. Possui 18 sondas virais e pode detectar dois grupos distintos: grupo A, de baixo risco (6, 11, 42, 43, 44),e grupo B, de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68). Sua sensibilidade é de 0,1 cópia de agente por célula.

O Quadro abaixo modificado por TROFFATTER (1997), mostram, respectivamente, as características dos métodos convencionais e as dos testes de DNA para a detecção de infecção de HIV.

QUADRO III –  CARACTERÍSTICAS DOS TESTES DE DNA PARA DETECÇÃO DA INFECÇÃO POR HPV

TESTE SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE FACILIDADE PARA
O TESTE
COMENTÁRIOS
Southern Blot Alta Alta Fraca Excelente para pesquisa e controle de qualidade, porém muito demorado e de difícil uso na clínica diária
Dot Blot Moderada Alta Boa Rápido e relativamente barato
Hibridização in situ Moderada Alta Boa Localiza DNA do HPV em tecidos
Hibridização in situ com filtro Fraca Fraca Boa Simples execução, porém pouco preciso
PCR Muito alta Alta Boa Altíssima  sensibilidade, porém alto risco de falso-positivo
Captura híbrida Alta Alta Boa Rápido e pode ser usado na clínica diária

Prof.: Dr Júlio José Máximo de Carvalho - Telefone: (11) 3832-0505

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